Hiperhomocisteinemia și patologia reproductivă

 

Veaceslav Moşin, Alina Hotineanu, Adrian Crețu, Vitalie Scurtu, Iuliana Holban

Centrul Medical „Repromed”

Articol publicat în “Buletinul de perinatologie” din Rep. Moldova, în 2014, nr.1 (61)

 

Rezumat

 Hiperhomocisteinemia defineşte starea în care concentraţiile aminoacidului neproteic homocisteina ‒ depăşeşte limitele normale. Mutaţiile în genele ciclului acidului folic (MTHFR, MTR, MTRR) au o contribuţie mare, împreună mai ales cu o dietă lipsită de vitamine, în special din complexul B. La ora actuală, hiperhomocisteinemia este un factor de risc pentru complicaţii ale sarcinii, precum: ruperea placentei, preeclampsia, defecte de tub neural, restricţii de creştere intrauterină, avorturi spontane. În legătură cu acestea, homocisteina este toxică pentru vasele sangvine şi poate iniţia o cascadă de complicaţii vasculare, inclusiv formarea de trombi. Testarea genetică a pacientelor va permite estimarea riscului de hiperhomocisteinemie şi tromboze, cu indicarea tratamentului corespunzător şi monitorizarea sarcinii.

 

Hiperhomocisteinemia

Homocisteina (Hcy) este un aminoacid neproteic ce conţine sulf, absent în dieta naturală și un intermediar metabolic în reacţii de transmetilare şi transsulfurare ‒ reacţii importante în creşterea, funcţionarea şi diferenţierea celulară normală [8].  În plasma sangvină Hcy se găseşte sub diverse forme: 70% din totalul de homocisteină (tHcy) circulă sub forma legată de proteină prin interacțiuni disulfidice (în principal albumine) [19]; aproximativ 25% se găsesc sub formă de dimeri de homocisteină, iar restul (5%) ‒ legate de alţi tioli, inclusiv cisteină, forma de Hcy redusă şi cea oxidată  [22].

Nivelul de Hcy plasmatică creşte cu vârsta, datorită declinului metabolic al Hcy în rinichi. Femeile au un nivel de Hcy mai scăzut decât bărbaţii, parţial din cauza influenţei hormonilor sexuali (estrogen şi progesteron) şi a menstruaţiei [20].

În condiţii fiziologice optimale cantitatea de Hcy la nivel celular este reglată pe două căi metabolice alternative: degradare ireversibilă prin transsulfurare sau remetilare cu formare de metionină [3]. Transsulfurarea, care decurge în mod special în ficat şi rinichi, constă în condensarea Hcy cu serină din care rezultă cistationină cu participarea enzimei cistationin-β-sintază şi a vitaminei B6 în calitate de cofactor. În etapa următoare, cistationin-γ-liaza degradează cistationina în cisteină şi α-cetobutirat. Cisteina este oxidată la atomul de sulf cu formare de sulfat anorganic excretat prin căi urinare [3]. Pe de altă parte, cisteina este un precursor al glutationului ‒ antioxidant esenţial în detoxifierea xenobioticelor.

În mod alternativ, Hcy este remetilată la metionină folosind donor de gruparea metil-5-metiltetrahidrofolat (5-metilTHF) sau betaină [16]. Pe această cale metabolismul Hcy este strâns conectat la ciclul folatului: enzima metionin-sintaza (MTR) catalizează transferul grupării metil de la 5-metilTHF la Hcy cu formare de metionină şi THF (tetrahidrofolat), reacţie ce decurge în toate celulele, în afară de eritrocite. MTR necesită cofactorul cobalamină (Cbl), iar complexul format Cbl(I)MTR leagă gruparea metil din care rezultă metilCbl(III)MTR. După transfer, Cbl(I)MTR este reformat şi poate accepta o altă grupare metil. Totodată cobalamina este ușor oxidată la forma Cbl(II), iar complexul Cbl(II)MTR devine inactiv. O altă enzimă ‒ metionin-sintaza reductaza (MTRR) ‒ are ca funcţie reactivarea complexului Cbl(II)MTR prin metilare reductivă [14].

Ulterior conversia THF la 5,10-metilenTHF este catalizată de enzima MTHFD1, iar restabilirea donorului de gruparea metil pentru remetilarea Hcy îi revine enzimei MTHFR care reduce 5,10-metilenTHF la 5-metilTHF, cofactor fiind vitamina B2 (riboflavina).

Metabolismul homocisteinei

Figura 1. Metabolismul homocisteinei: calea de remetilare la metionină şi calea de transsulfurare cu formare de produşi ca cisteina şi sulfat

 

Hiperhomocisteinemia (HHcy)

HHcy este o consecinţă a deficienţelor enzimatice şi/sau a carenţelor nutriţionale de vitamine care interferează cu metabolismul normal al metioninei şi/sau Hcy. Creşterea concentraţiei de Hcy extracelulare este toxică pentru celule şi ţesuturi şi poate iniţia o cascadă de complicaţii vasculare [25]. Limitele normale ale Hcy se situeaza între 5 şi 15 μM [11]. Valori mai mari se asociază cu formele: intermediară (15-30 μM), moderată (30-100 μM) şi severă (>100 μM) de HHcy [12]. Există o interacţiune complexă între factorii genetici, metabolici şi de mediu pentru a menţine nivelul homocisteinei în limitele normei. Schimbări ale unui factor, sau combinaţii de factori pot creşte nivelul de tHcy (homocisteină totală). După Steeed [25] au fost studiate 4 stări ce explică dezvoltarea HHcy: 1) dieta bogată în metionină; 2) deficienţa de vitamine (B12, B6 şi folaţi);
3) disfuncţii renale; 4) anomalii genetice (în genele MTHFR, MTR, MTRR, CBS).

fig2

Figura 2. Factorii hiperhomocisteinemiei (HHcy): 4 căi de acumulare a homocisteinei

Să le examinăm mai detaliat:

1) Jumătate din cantitatea de metionină primită prin aport alimentar este transformată în Hcy [7]. Studiile pe animale sugerează că dieta bogată în metionină în prezenţa vitaminelor B6, B12 şi deficienţa de acid folic pot creşte riscul aterosclerozei şi patologiilor coronare vasculare, în timp ce dieta bogată în alimente vegetale şi fructe menţine nivelul Hcy în limite normale [1].

2) Cofactorii derivaţi din vitaminele complexului B (B2, B6, B9, B12) participă în reacţii enzimatice ce reglează metabolismul Hcy. Mai multe studii demonstrează că indivizii cu hiperhomocisteinemie prezintă concentraţii inadecvate ale unui sau mai multor cofactori enzimatici [23]. Iar concentraţia Hcy este invers proporțională cu concentraţia plasmatică a folatului, vitaminei B12 şi B6 [10]. Acidul folic (forma solubilă a vitaminei B9) este necesar în dividere celulară şi diferenţiere, în special în timpul gravidităţii. Derivaţii acidului folic sunt donori ai unităţilor mono-carbonice pentru sinteza purinelor şi pirimidinelor componente ale ADN-ului şi ARN-ului, iar prin donarea de grupare metal ‒ participă la reglaj epigenetic.

3) Rinichii repezintă site-ul major al metabolismului Hcy posedând cele 3 enzime: MTR, CBS şi  cistationin-γ-liaza [9]. Disfuncţiile renale sunt acompaniate cu creşterea nivelului de tHcy, iar studiile lui Arnadottir evidenţiază o relaţie invers proporţională între rata de filtrare glomerulară măsurată şi  nivelul de tHcy.

4) Anomalii genetice în enzimele metabolismului Hcy pot determina creşterea concentraţiei de tHcy, iar severitatea modificărilor depinde de site-ul mutaţiei genice [25]. Cel mai acceptat polimorfism asociat cu variabilitatea Hcy este 677C>T în gena MTHFR care substituie Ala în Val în componenţa enzimei. Kang şi colab. au identificat o variantă a enzimei MTHFR caracterizată prin activitate redusă şi „termolabilitate” [13]. Activitatea enzimatică în cazul genotipurilor heterozigot CT şi homozigot TT se reduce cu 35% şi respectiv 70% [25], iar forma termolabilă este un marker genetic al HHcy moderate la subiecţii cu genotipul 677TT (3). Totodată, această asociere este observată doar concomitent cu concentraţii inadecvate de folaţi. Studiile lui  Guenthler (1999) au arătat pe modelul E.coli că slăbirea legării FAD este responsabilă de reducerea activitaţii enzimatice, iar rolul protector împotriva pierderii FAD-ului îl joacă chiar folaţii [6].

Polimorfismul 1298A>C al genei MTHFR constă în schimbarea Glu cu Ala. Este relevant faptul că nici statutul homozigot, nici cel heterozigot al polimorfismului nu modifică nivelul de Hcy plasmatică [15]. Însă starea de heterozigot compound pentru C677T şi A1298C se asociază cu activitate enzimatică redusă, nivel ridicat de Hcy şi concentraţii plasmatice scăzute de folaţi [5].

În polimorfismul 66A>G al genei MTRR izoleucina este substituită cu metionina. Unele studii raportează acest polimorfism drept factor de risc pentru DTN (defecte de tub neural) [21].

 

Homocisteina şi bolile cardiovasculare

Primele evidenţe despre potenţialele efecte negative ale Hcy asupra peretelui vascular au fost raportate de către McCully în 1969 [18]. La 2 pacienţi cu HHcy severă datorate erorilor înnăscute ale metabolismului Hcy au fost depistate leziuni vasculare similare, iar „Teoria Homocisteinei” postulează că Hcy şi derivaţii săi sunt toxice pentru vasele sangvine. Pe de altă parte, rezultatele unor metaanalize ce au cuprins 24100 subiecţi arată că terapia de normalizare a nivelului homocisteinei nu reduce riscul infarctului miocardic şi cerebral, lucru explicat prin faptul că aceste încercări s-au bazat şi pe prescripţia de acid folic [17]. Suplinirea terapiei cu folaţi este benefică pe o parte, dar efectul antagonist este accelerarea proliferării şi inflamării ‒ procese esenţiale în formarea plăcii aterosclerotice, în principal datorită rolului metabolismului folatului de a furniza unităţi mono-carbonice pentru sinteza purinelor şi pirimideinelor din structura ADN-ului şi ARN-ului [4].

Studii recente descriu 3 mecanisme patologice ce stau la baza complicaţiilor vasculare provocate de Hcy: stresul oxidativ, disfuncţie endotelială şi remodelare vasculară ‒ integrate în „Triada toxică” [4].

fig3

Figura 3. Triada toxică:  Mecanismele patologice ce stau la baza bolilor vasculare provocate de homocisteină.

Cercetările sugerează că Hcy atacă în primul rând endoteliul vascular şi iniţiază o cascadă de complicaţii vasculare. Observaţiile clinice şi studiile pe animale au identificat posibilele ţinte ale Hcy: EC (сelule ale endoteliului), VSMCs (celule musculare), ţesuturi conective, trombocite, factori de coagulare, lipide, molecule de transducere a semnalelor prin NO (oxid nitric) [25]. Totuşi, nu există o ipoteză unificată ce ar explica modul în care Hcy provoacă afectarea vaselor. Efectele la nivel molecular şi celular ale HHcy sunt reflectate în tabelul 1.

 

Tabelul 1. Mecanismele hiperhomocisteinemiei

Efectele moleculare ale HHcy Efectele celulare ale HHcy
Reducerea produţiei de NO (oxid nitric) Disfuncţie endotelială
Reducerea cantităţii de NO disponibil Afectarea vasorelaxarii celulelor endoteliale
Stres oxidativ Lezarea mitocondriilor
Peroxidarea lipidelor Proliferarea celulelor musculare netede
Inflamarea Degradarea matrixului extracelular
Coagularea Lezarea ADN-ului şi ARN-ului
Formarea trombilor Apoptoza

 

Materiale şi metode: Grupul de cercetare l-au constituit pacientele Centrului medical cu probleme ale reproducerii, inclusiv avorturi spontane şi pierderi de sarcină recurente. ADN-ul genomic a fost extras după kit-uri specializate (GeneJet Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit, Fermentas) din leucocitele sângelui periferic. Probele de sânge au fost colectate în tuburi de unică folosinţă cu EDTA, prin puncţie venoasă.

Pentru testarea genetică a polimorfismelor MTHFR C677T, MTHFR A1298C, MTR A2756G şi MTRR A66G s-au realizat reacţiile PCR/RFLP (reacţie de polimerizare în lanţ şi polimorfismul lungimii fragmentelor de restricţie) cu primeri specifici  preluaţi din articolele din literatura de specialitate [2,27,24]. ADN-ul genomic a fost amplificat utilizând polimeraza Dream Taq („Fermentas”, USA), la termociclul “TProfessional Basic 96” (Biometra, Germania). Condiţiile reacţiei sunt similare pentru toate polimorfismele cu excepţia temperaturii de aliniere a primerilor:  60.4°C pentru MTHFR C677T, 61°C pentru MTHFR A1298C, 58.4°C – MTR A2756G, 57.6°C –MTRR A66G, iar condiţiile protocolului standard sunt: denaturare iniţială la 95°C ‒ 3 minute, 33 cicluri: 94°C ‒ 30 secunde, 57.6 – 61°C ‒ 30 secunde, 72°C ‒ 30 secunde şi elongaţia finală la 72°C ‒ 5 minute.

Ampliconii au fost supuşi restricţiei timp de 3 ore la 37°C cu enzimele de restricţie specifice pentru fiecare polimorfism: Hinf I pentru MTHFR C677T, Mbo II pentru MTHFR A1298C, Hae III ‒  MTR A2756G şi Nde I ‒ MTRR A66G.

Verificarea produşilor de restricţie s-a efectuat prin electroforeză în gel de PAAG (poliacrilamidă) cu concentraţia de 7,5% ‒ sub condiţiile: 200 V timp de 3 ore. Gelul a fost colorat cu soluţie de bromură de etidiu. Iar rezultatele au fost vizualizate la sistemul UV SOLO (Germania). Mărimile fragmentelor sunt reflectate în figura 4.

fig4a

fig4

 

Figura 4. Electroforegrama analizei PCR / RFLP a polimorfismelor genelor ciclului folat:

  1. A) MTHFR C677T: M ‒ marker de 50 pb; 1 ‒ amplicon (227 pb); 4 – 8 ‒ homozigot normal (205 pb); 2 ‒ heterozigot (205, 129, 76 pb); 3 ‒ homozigot după mutaţie (129, 76 pb);
  2. B) MTHFR A1298C: M ‒ marker de 50 pb; 1 ‒ amplicon (163 pb); 4 ‒ homozigot normal (56, 31, 30, 18 pb); 3, 5, 7 ‒ heterozigot (84, 56, 31, 30, 18 pb); 2 ‒ homozigot după mutaţie (84, 31, 30, 18 pb);
  3. C) MTR A2756G: 2, 3, 5, 6, 9 ‒ homozigot normal (421, 81 pb); 1, 4, 7, 8 ‒ heterozigot (421, 269, 152, 81 pb); 10 ‒ homozigot după mutaţie (269, 152, 81 pb);
  4. D) MTRR A66G: M ‒ marker de 50 pb; 2 – amplicon (145 pb); 5, 6 ‒ homozigot normal (145 pb); 4 – heterozigot (145, 123, 22 pb); 3 ‒ homozigot după mutaţie (123, 22 pb).

 

Rezultate şi discuţii: Rezultatele genotipării sunt prezentate în diagramele 1 – 4. Pentru evaluarea veridicităţii rezultatelor obţinute au fost utilizate formulele general acceptate din statistica variaţională, cu ajutorul programului SISA. În acest context, au fost calculate frecvenţele alelelor și claselor genotipice după formula lui Hardy-Weinberg, iar pentru compararea frecvenţelor genotipurilor s-a utilizat criteriul lui Pirson – X2 .

 

diagrama1

Diagrama 1. Repartiţia frecvenţelor claselor genotipice după polimorfismul MTHFR C677T

 

 

diagrama2

Diagrama 2. Repartiţia frecvenţelor claselor genotipice după polimorfismul MTHFR A1298C

 

 

diagrama3

Diagrama 3. Repartiţia frecvenţelor claselor genotipice după polimorfismul MTRR A66G

 

 

diagrama4

Diagrama 4. Repartiţia frecvenţelor claselor genotipice după polimorfismul MTR A2756G

 

La compararea repartiţiei frecvenţei genotipurilor observate şi celor teoretic aşteptate prin testul X2 nu a fost elucidată deviaţie statistic semnificativă de la echilibrul Hardy-Weinberg nici pentru un polimorfism studiat: MTHFR C677T (X2=0.575; p>0.05); MTHFR A1298C (X2=3.766; p=0.052); MTR A2756G (X2=2.332; p>0.05); MTRR A66G (X2=2.230; p>0.05);

 

Concluzii.

1) Homocisteina în cantitate mare are efect toxic asupra endoteliului vaselor sangvine stimulând formarea de trombi.

2) Hiperhomocisteinemia constituie factor de risc pentru complicaţiile sarcinii la diverse perioade, inclusiv preeclampsia, ruperea placentei, restricţii de creştere intrauterină şi avorturi spontane.

3) Testarea genetică după mutaţiile în genele metabolismului homocisteinei şi acidului folic permite estimarea riscurilor şi prescrierea unui tratament corespunzător.

 

 

Bibliografie.

  1. Appel LJ, Moore TJ et al., A clinical trial of the effects of dietary patterns on blood pressure.   DASH Collaborative Research Group.N Engl J Med336: 1117–1124, 1999.
  2. Barbosa PR, Stabler SP., Association between decreased vitamin levels and MTHFR, MTR and MTRR gene polymorphisms as determinants for elevated total homocysteine concentrations in pregnant women. In: European Journal of Clinical Nutrition 62, 1010–1021, 2008.
  3. Blom HJ, Genetic determinants of hyperhomocystenaemia: the roles of cystathionine beta-synthase and 5, 10-methylenetetrahydrofolate reductas. In: Eur J Pediatr 159:208-212, 2006
  4. Blom Hj Overview of homocysteine and folate metabolism. With special references to cardiovascular disease and neural tube defects. In: J Inherit Metab Dis 34:74-81, 2011
  5. Botto, L. D., and Yanq, Q. 5, 10-Methylenetetrahydrofolate reductase gene variants and congenital anomalies. In: Am. J. Epidemiol.151, 862–877, 2000.
  6. Castro R. et al, homocysteine metabolism, hyperhomocystenaemia and vascular disease: An overview. In: J.Inherit Metab. Dis 29: 3-20, 2006.
  7. Carlsen SM, Fulling I et al., Metformin increases total serum homocysteinelevels in non-diabetic male patients with coronary heart disease. In: Scand J Clin Lab Invest57: 521–527, 1997.
  8. Eldibany M et al., Hyperhomocysteinemia and thrombosis. Overview, In: Arch Pathol Lab Med, 131, 2007
  9. Finkelstein JD. Methionine metabolism in mammals. In: J NutrBiochem1: 228–237, 1990
  10. Graham IM, O’Callagham P et al., Vitamins, homocysteine and cardiovascular risk. In: Cardiovasc Drugs Ther 16: 383-389, 2002.
  11. Jacobsen DW, Gatautis VJ et al., Rapid HPLC determination of total homocysteine and other thiols in serum and plasma: sex differences and correlation with cobalamin and folate concentrations in healthy subjects. In: Clin Chem 40:873–881, 1994
  12. Kang SS, Wong PW et al., Hyperhomocysteinemia as a risk factor for occlusive vascular disease. In: Ann Rev Nutr 12: 279–298, 1992.
  13. Kang SS, Zhou J. et al., Intermediate homocysteinemia: a thermolabile variant of methylenetetrahydrofolate reductase. In: Am J Hum Genet 43:414-421, 1988.
  14. Leclerc D, Wilson A. et al, Clonning and mapping of cDNA for methionine synthase reductase, a flavoprotein defective in patients with homocystinuria. In: Proc Natl Acad Sci USA 95:3059-3064, 1998
  15. Lievers, K. et al., A second common variant in the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene and its relationship to MTHFR enzyme activity, homocysteine, and cardiovascular disease risk. In: J. Mol. Med. 79, 522–528, 2001.
  16. Li YN, Gulati S , et al, Cloning, mapping and RNA analysis of human methionine synthase gene. In: Hum Mol Gene 5:1851-1858, 1996.
  17. Marti-Carvajal AJ et al., Homocysteine lowering interventions for preventing cardiovascular events. In: Cochrane Database Syst rev CD006612, 2009.
  18. McCully KS, Vascular pathology of homocysteinemia: implicationsfor the pathogenesis of arteriosclerosis. In: Am J Pathol 56:111-128, 1969.
  19. Mudd SH, Finkelstein JD, et al., Homocysteine and its disulfide derivatives: A suggested consensus terminology. In: Arterioscler Thromb Vasc. Biol20: 1704–1706, 2000
  20. Nygard O, Vollset S.E. et al., Total plasma homocysteine and cardiovascular risk profile. The Hordaland Homocysteine Study. In: JAMA 274: 1526–1533, 1995.
  21. Ouyang Sh, Li YN et al., Association between MTR A2756G and MTRR A66G polymorphisms and maternal risk for neural tube defects: a meta-analysis. In: Gene 515. 308-312, 2013.
  22. Refsum H, Ueland PM, Nygard O, and Vollset SE. Homocysteine and cardiovascular disease. In: Annu Rev Med49: 31–62, 1998
  23. Robinson K, Mayer EL et al., Hyperhomocysteinemia and low pyridoxal phosphate. In: Circulation 92: 2825-2830, 1995
  24. Rohini R.N., Khanna A. et al., Association of maternal and fetal MTHFRA1298C polymorphism with the risk of pregnancy loss: a study of an Indian population anda meta-analysis, In: Fertility and Sterility 99, N. 5, 2013
  25. Steed M, Tyagi S., Mechanisms of cardiovascular remodeling in hyperhomocysteinemia, In: Antioxidants & Redox Signaling, vol. 15, Nr.7, 2011
  26. 26. Thomas P, Fenech M., Methylenetetrahydrofolate reductase, common polymorphisms and relation to disease, In: Vitamins and Hormones 79, 2008.
  27. Калашникова Е.А., Кокаровцева С.Н. Ассоциация наследственных факторов тромбофилии с невынашиванием беременности у женщин в русской популяции, 2008