Metode de diagnostic prenatal: QF-PCR, cariotipul, FISH, NIFTY

Veaceslav Moşin, Alina Hotineanu, Adrian Crețu, Rodica Certan-Bejan, Veaceslav Moşin jr.
Centrul Medical „Repromed
Articol publicat în “Buletinul de perinatologie” din Rep. Moldova, în 2015, nr.4 (68)

REZUMAT

Citogenetica modernă împreună cu progresele semnificative ale tehnologiilor molecular-genetice au creat premisele unui diagnostic mult mai precis şi mai precoce al bolilor genetice, ceea ce a făcut ca diagnosticul prenatal să devină un instrument extrem de eficient pentru medicul ginecolog şi genetician.
Dezvoltarea unor tehnici moleculare de diagnostic prenatal din ce în ce mai sofisticate au condus la o explozie de informații care necesită a fi aplicate de medici în beneficiul pacienților. Prin acest articol dorim să facem o sinteză a metodelor clasice şi a celor moderne pentru diagnosticul prenatal al bolilor genetice, pentru a pune în balanţă beneficiile precum şi riscurile fiecărei metode, atât pentru mamă cât şi pentru făt.

Introducere. Cele mai multe dintre femeile care se decid să facă diagnosticul prenatal o fac pentru a evita naşterea unui copil cu anomalii cromozomiale. Cromozomii sunt unităţi microscopice prezente în toate celulele corpului. Celulele somatice umane conțin fiecare câte 23 de perechi de cromozomi. Câștigarea sau pierderea de cromozomi în celulele umane va cauza malformații genetice fetale şi perturbări ale dezvoltării embriofetale. Trisomia 21 (sindromul Down), 18 (sindromul Edwards) și 13 (sindromul Patau) sunt cele mai cunoscute trei anomalii cromozomiale, care sunt cauzate de prezența unui număr suplimentar al cromozomilor 21, 18, respectiv 13. Aneuploidiile cromozomilor sexuali se caracterizează prin adaosul sau pierderea unui cromozom X sau Y: monosomia X (sindromul Turner), XXY (sindromul Klinefelter), XXX (Triplu X), XYY [1].
Materialul genetic suplimentar poate provoca unele caracteristici dismorfice, defecte fizice grave prezente încă de la naştere, malformaţii congenitale şi handicap intelectual de diferite grade.

Ecografia este utilă în identificarea prenatală a aneuploidiilor, deoarece feţii cu cariotip anormal au deseori modificări sau defecte structurale sugestive, vizibile ecografic. Markerii ecografici ai aneuploidiilor, evidenţiabili în trimestrul I al sarcinii: – translucenţa nucală; – osul nazal (absenţa sau hipoplazia); – velocimetria ductului venos (absenţa sau inversarea fluxului pe ductul venos în timpul contracţiei atriale); – regurgitatea tricuspidiană (regurgitatea sângelui prin valva tricuspidă). În trimestrul II al sarcinii, markerii ecografici ai aneploidiilor pot fi: – anomalii cerebrale (ventriculomegalie, microcefalie); – anomalii ale cordului şi ale vaselor mari; – anomalii urogenitale; – anomalii toracice; – anomalii ale membrelor; – anomalii digestive şi ale peretelui abdominal [2,3].

Diagnosticul prenatal prin amniocenteză. Amniocenteza constă în extragerea unei cantităţi mici din lichidul amniotic care înconjoară fătul din uter. Procedura se efectuează într-un spital sau o clinică de obstetrică şi ginecologie când vârsta sarcinii este de 15-20 săptămâni (optim la 16-18 săpt.).
Înainte de aplicarea acestei proceduri medicul efectuează o scanare ecografică (ultrasonografie) care va releva imagini despre uter, placentă, lichidul amniotic şi fetus. După vizualizare, medicul va introduce un ac extrem de fin, străbătând peretele abdominal al femeii, în uter, şi va preleva aproximativ 5-20 ml de lichid amniotic. Această etapă durează doar câteva minute. După prelevarea probei se efectuează o nouă verificare ecografică a stării fătului [4].

Amniocenteza
Fig.1: Amniocenteza

Amniocenteza a devenit o metodă de rutină la începutul anilor 1970. Amniocenteza nu este total exceptată de riscuri.
Celulele din lichidul amniotic descuamate din tegumentele şi mucoasele fetusului sunt cultivate în condiţii speciale şi apoi testate pentru prezenţa anomaliilor cromozomale, în cazul cariotipării. Amniocitele pot fi examinate şi fără necesitatea cultivării, în cazul metodei FISH sau QF-PCR.
Fiecare metodă de diagnostic are atât avantaje cât şi dezavantaje, de aceea selectarea metodei optime de diagnostic trebuie făcută în urma unei consilieri, în comun cu medicul ginecolog şi genetician.

QF-PCR = Quantitative Fluorescent PCR (PCR fluorescent cantitativ): Avantajele metodei constau în rapiditatea obţinerii rezultatului, care poate fi efectuat în câteva ore, și ne mai oferă informația privitor la sexul fătului. Precizia metodei este de circa 99,5%. Pentru analiza
QF-PCR sunt necesare doar 2-3 ml de lichid amniotic, prelevați prin amniocenteză. Analiza se poate face de la 14 săptămâni de sarcină. Avantajul față de metoda FISH este faptul că analiza probelor este automatizată, ceea ce micșorează costurile [2].
Prin metoda QF-PCR la analizorul genetic automatizat este analizat ADN-ul fetal, mai exact sunt amplificaţi prin PCR multiplex (reacţia de polimerizare în lanţ), iar ulterior analizaţi 28 de markeri STR (short tandem repeats) – loci specifici pentru cromozomii 13, 18, 21, X şi Y. Pe baza electroforegramelor obţinute în urma electroforezei capilare la secvenţiator (analizor genetic automatizat) şi procesării datelor într-un soft specializat, se poate elibera concluzia privitor la lipsa sau prezenţa aneuploidiilor pentru cromozomii 13, 18, 21, X şi Y [5].
În mod normal raportul între alelele aceluiaşi marker este de 1:1, se admite un interval de limite care să se încadreze între 0.8 – 1.4, pentru ca raportul să fie considerat normal.
Intervalul trialelic este caracteristic în cazul trisomiilor. Trei alele sunt evidente prin trei vârfuri (peak-uri) într-un raport de 1:1:1 (Fig.2,a), sau două alele în raport de 2:1 sau 1:2 (Fig.2,b).
În cazul apariţiei doar a unei singure alele, adică vizualizarea unui singur vârf (peak) pentru un marker, respectivul marker este considerat noninformativ.

QF-PCR, trei alele în raport de 1:1:1
Fig.2,a: QF-PCR, trei alele în raport de 1:1:1

QF-PCR, trei alele în raport de 1:2
Fig.2,b: QF-PCR, două alele în raport de 1:2

Pentru a interpreta un rezultat, este important să existe o coerență între toţi markerii specifici aceluiași cromozom [5].

QF-PCR: 46, XX – lipsa aneuploidiilor ale cromozomilor 21, 18, 13, X, Y
Fig. 3: QF-PCR: 46, XX – lipsa aneuploidiilor ale cromozomilor 21, 18, 13, X, Y

Cariotipul fetal: metoda cariotipării constă în prelevarea lichidului amniotic şi punerea acestuia în mediu de cultură cu obţinerea de metafaze şi studierea lor. Mai întâi se efectuează puncţia amniotică (amniocenteza), sub ghidaj ecografic în timp real. La amniocenteză se prelevează aproximativ 5-20 ml lichid amniotic care conţine amniocite, ce vor fi cultivate în medii speciale, în incubator cu CO2. Analiza cromozomilor se face cu ajutorul unui microscop, la care se ataşează o cameră video pentru captarea imaginilor şi prelucrarea lor ulterioară într-un soft specializat. Rezultatul este eliberat în aproximativ 2-3 săptămâni. Există riscul de infectare a culturilor de amniocite. Metoda dată nu ne oferă informaţii despre modificările apărute la nivelul genelor. Analiza se face în intervalul de 15-20 săptămâni de sarcină. Metoda cariotipării fetale este considerată “golden standard” (standardul de aur) pentru diagnosticul prenatal [4].
Cariotipul fetal se poate obţine şi în urma unei biopsii de vilozități coriale (CVS) care se poate face la un termen de aproximativ 10-12 săptămâni de sarcină, dar riscul de avort spontan este mult mai crescut ~ 1/100.

Cariotip: 46, XX
Fig.4: Cariotip: 46, XX

FISH (hibridizarea fluorescentă in situ): Tehnică de citogenetică moleculară care permite localizarea unei secvenţe specifice de ADN într-un cromozom, utilizată în scopul identificării anomaliilor cromozomiale, numerice şi structurale. Se folosesc probe oligonucleotidice marcate fluorescent pentru diagnosticul aneuploidiilor cromozomilor 13, 18, 21, X şi Y. Se realizează pe nuclei interfazici, fără să fie nevoie de efectuarea de culturi celulare [5, 6].
Mai multe sindroame dismorfice (sindromul Williams, Prader-Willi, Angelman, Di George) produse de microdeleţii sau microduplicaţii, suspectate clinic, imposibil de observat prin tehnicile citogenetice convenţionale, pot fi evidenţiate prin FISH-ul metafazic.
Principiul metodei constă în realizarea unei hibridizări, pe bază de complementaritate, între o secvenţă – ţintă de ADN al cromozomului analizat şi o sondă de ADN specifică marcată fluorescent. Hibridizarea sondei cu ADN-ul celular este vizualizată la microscopul cu fluorescenţă echipat cu filtre de excitaţie şi emisie, ceea ce permite citirea semnalelor specifice zonei-ţintă. Se numără şi se analizează semnalele prezente în aproximativ o sută de celule (de ex. trei semnale fluorescente specifice pentru cromozomul 21 indică sindromul Down).
Tehnica FISH a fost introdusă ca o metodă de diagnostic prenatal la începutul anilor 1990 [2].
Rezultatul se eliberează în aproximativ 2-3 zile și sunt necesari 5-10 ml de lichid amniotic. Se recomandă ca amniocenteza să se efectueze după 16 săptămâni de sarcină, când cantitatea de celule fetale în lichidul amniotic este mai mare.

FISH – 47,XXY
Fig.5: FISH – 47,XXY

NIFTY – test noninvaziv al trisomiei fetale. NIFTY este un test efectuat din sângele mamei, care detectează aneuploidiile cromozomilor 13, 18, 21, X şi Y, dar și alte sindroame genetice fără a prezenta riscuri pentru făt sau mamă. Acest test neinvaziv al trisomiei fetale este un test de screening prenatal.
Principiul metodei: fragmente de ADN liber circulant (cfDNA) sunt fragmente scurte de ADN care pot fi găsite în sânge. În timpul sarcinii, fragmentele de cfDNA originare atât de la mamă cât şi de la făt sunt prezente în circulaţia sângelui matern. ADN-ul fetal liber circulant (cffDNA – cell free fetal DNA) – este prezent ca o componentă minoră din totalul de cfDNA în plasma maternă [7].
Testul constă în prelevarea unei probe de sânge venos de 10 ml de la femeia însărcinată în săptămânile de sarcină 10 – 24. Din această probă de sânge periferic matern se analizează ADN-ul fetal (cffDNA) pentru a detecta anomalii cromozomiale, folosind tehnologia secvenţierii de ultimă generaţie (NGS) cuplată cu analiza bioinformatică avansată. În cazul prezenţei aneuploidiei, pe cromozomii afectaţi vor fi detectate mici excese sau deficite de ADN. Prin utilizarea tehnologiei de secvenţiere masiv paralelă (MPS) se secvenţiază milioane de fragmente de ADN atât fetale cât şi materne şi se face compararea cromozomilor din eşantionul testat cu cromozomii de referinţă pentru a determina prezenţa anormalităţilor.
De asemenea, testul NIFTY permite testarea şi pentru anumite sindroame de deleţie, cum ar fi: 5p (sindromul Cri-du-Chat), 1p36, 2q33.1. Având această informație, este posibilă și identificarea sexului copilului (masculin/ feminin) [7,8].

ADN-ul fetal liber circulant în sângele matern
Fig.6: ADN-ul fetal liber circulant în sângele matern

Avantajele testului NIFTY:
Grad ridicat de precizie: Se bazează pe tehnologia de analize bioinformatice secvenţiale (NGS), rata de detectare >99%.
Neinvaziv: Este nevoie doar de 10 ml de sânge venos matern. Prin urmare, nu există nici un risc pentru o eventuală infecție intrauterină și avort.
– Fără risc: Evită infecția intrauterină și avortul indus.
Detectare incipientă: Efectuat în primele 10 săptămâni de sarcină, acesta permite o detectare din timp pentru o mai bună decizie clinică [7].

Tabel 1: Comparație între metodele de diagnostic şi cele de screenig prenatal

Metoda

Rata de detecţie, riscuri

Săptămâna de sarcină

Timp de răspuns

Test invaziv sau neinvaziv

Screening biochimic, markeri sânge matern

Rata de detecţie ~60-80%, procent fals pozitiv 5%,
fără risc de avort

11 – 13+6 s
15 – 20 s

1 zi

neinvaziv

Markerii ecografici în trimestrul I al sarcinii. Translucența nucală (NT)

Rata de detecţie ~60-80%,
Procent fals pozitiv 5%,
fără risc de avort

11 – 13+6 s

rezultat în aceeași zi

neinvaziv

Amniocenteză +
cariotip fetal

Rata de detecţie >99%,
risc de avort ~0.5%

15 – 21 s

2-3 săptămâni

invaziv

Biopsia de vilozități coriale (CVS)

Rata de detecţie >99%,
risc de avort ~1-2%

10 – 12 s

2-3 săptămâni

invaziv

Cordocenteza. Probă percutanată de sânge ombilical

Rata de detecţie >99%,
risc de avort ~0.5-1%

18 – 23 s

4-5 zile

invaziv

FISH

Rata de detecţie >99%,
risc de avort ~0.5%

16 – 21 s

2-3 zile

invaziv

QF-PCR

Rata de detecţie >99%,
risc de avort ~0.5%

14 – 24 s

1-2 zile

invaziv

NIFTY

Rata de detecţie >99%,
fără risc de avort

10 – 24 s

2-3 săptămâni

neinvaziv

Concluzii
Se poate conchide, fără rezervă, că bolile genetice reprezintă o problemă majoră de sănătate publică impunând acţiuni concrete şi eficace de diagnostic şi un program naţional de profilaxie a bolilor genetice bazat pe sfat genetic, screening şi diagnostic prenatal.
Testarea prenatală, chiar dacă uneori poate constitui o sursă de disconfort pentru mamă şi risc pentru făt, are rolul de a permite evitarea naşterii unui copil cu malformaţii, în baza unei consilieri genetice şi a deciziilor luate de cuplu, decizia unui avort terapeutic fiind lăsată la latitudinea familiilor afectate.
Consilierea genetică este crucială pentru a ajuta pacientul să înțeleagă rezultatul testului și să-l perceapă în contextul circumstanțelor sale de viață, misiunea medicilor fiind de a îngriji şi de a informa pacienţii pentru luarea unor decizii corecte.
Dilema care stă în faţa noastră: Genetica vs Bioetica vs Eugenism.

Bibliografie
1. Weaver BA, Silk AD, Cleveland DW. Cell biology: nondisjunction, aneuploidy and tetraploidy. Nature, 2006; 442(7104) (E9-10).
2. Neagoş Daniela, Bohîlţea Laurenţiu, Creţu Ruxanda. Anomalii cromozomiale umane: aspecte genetice în diagnosticul prenatal. Editura ALL, 2013.
3. Nicolaides KH. Screening for fetal aneuploidies at 11 to 13 weeks. Prenat Diagn, 2011; 31(1):7–15.
4. Covic Mircea, Ştefănescu Dragoş, Sandovici Ionel. Genetică medicală. Ediţia a II-a, Ed. Polirom, 2011
5. Hamilton S., Mann K. QF-PCR for the diagnosis of aneuploidy Best Practice Guidelines v2.01. Association for Clinical Cytogenetics, 2007.
6. Mann K, Donaghue C, Fox S P, Docherty Z and Ogilvie C M. Strategies for the rapid diagnosis of chromosome aneuploidy. E J Hum Genet, 2004; 12: 907-915.
7. Broşura NIFTY test, BGI diagnostics, 2014.
8. Sparks AB, Wang ET, Struble CA, et al. Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood for evaluation of fetal trisomy. Prenat Diagn, 2012; 32(1):3-9.