Trombofilia ereditară și patologia reproductivă

Veaceslav Moşin, Alina Hotineanu, Adrian Crețu, Vitalie Scurtu, Iuliana Holban

Centrul Medical „Repromed”

Articol publicat în “Buletinul de perinatologie” din Rep. Moldova, în 2014, nr.1 (61)

REZUMAT

 

Cuvinte-cheie: trombofilie; factorul V (mutaţia Leiden); protrombina (factorul II) G20210A; Plasminogen Activator Inhibitor 1 (PAI-1) 4G/5G; infertilitate

 

Trombofilia ereditară este o boală genetică care poate apărea la orice persoană, este moștenită de la părinți și apare datorită unor mutații la nivel de ADN. Se caracterizează prin faptul că crește riscul formării de trombi (cheaguri) în vasele sangvine care pot avea un impact negativ (direct sau indirect) pentru viața oricărei persoane. Prezența mutațiilor genetice implicate în trombofilia ereditară, cum ar fi factorul V, factorul II sau PAI-1, pot provoca infertilitate la femei, sau pot duce la imposibilitatea nașterii unui copil sănătos și la termen. Femeilor ce suferă de infertilitate li se recomandă să efectueze analize molecular-genetice pentru depistarea mutațiilor ADN care pot duce la trombofilie, astfel se va putea calcula riscul de tromboză, se va decide dacă este necesar un tratament sau dacă trebuie să se intervină asupra factorilor de risc reversibili.

 

SUMMARY

Inherited thrombophilia and reproductive pathology

 

Keywords: thrombophilia; factor V (Leiden mutation); prothrombin (factor II) G20210A; Plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1) 4G/5G; infertility

 

Inherited thrombophilia is a genetic disorder of haemostasis that appears to predispose to blood clotting. Thrombosis have a negative impact (directly or indirectly) to any person’s life. Genetic mutations in genes such as factor V, factor II and PAI-1 can shift haemostatic balance between pro- and anticoagulant forces in favor of coagulation. There is an evidence that inherited thrombophilia may increase the risk of fetal loss, vascular complications of pregnancy (like intrauterine growth restriction or preeclampsia) and consequently it can be a cause of female infertility. Women affected by infertility or pregnancy loss are advised to undergo  genetic testing for mutations involved in thrombophilia in order to estimate the risk of thrombosis  and  decide whether patients  need treatment and intervention on risk factors.

 

Резюме

Наследственная тромбофилия и репродуктивная патология

 

Ключевые слова : тромбофилия, фактор V (мутация Лейден), протромбин (фактор II) G20210A, ингибитор активатора плазминогена-1 (PAI-1) 4G/5G, бесплодие

Наследственная тромбофилия является генетическим заболеванием, которое может произойти у любого человека, наследуется от родителей и происходит из-за мутаций на уровне ДНК. Она характеризуется тем, что повышает риск тромбоза в кровеносных сосудах, которые могут оказать негативное воздействие (прямое или косвенное) на жизнь любого человека. Генетические мутации, участвующие в наследственной тромбофилии, такие как фактор V, фактор II или PAI-1, могут быть причиной женского бесплодия, или могут увеличить риск потери плода. Женщинам, страдающим от бесплодия, рекомендуется проведение молекулярно-генетического тестирования для выявления мутаций ДНК, которые могут привести к тромбофилии, чтобы оценить риск тромбоза и решить, нужно ли им лечение или же вмешательство в отношении факторов с обратимым риском.

Introducere.

 

Trombofilia este o anomalie a coagulării ce crește riscul de tromboză ‒ formarea de trombi (cheaguri) în vasele sangvine.

Condiţii care favorizează coagularea pot fi: sarcina, contraceptivele orale, fumatul, terapia estrogenică, vârsta înaintată, hiperhomocisteinemia, malignităţile, stroke cu pareza extremităţilor, traumatismele, obezitatea, alimentația neechilibrată, intervenţiile chirurgicale majore, diabetul zaharat, lupusul anticoagulant, imobilizarea prelungită, sedentarismul.

Graviditatea se asociază în mod normal cu o stare de hipercoagulabilitate fiziologică, menită să limiteze sângerarea post-partum (după naștere).

Pentru femeile gravide, cărora li s-au depistat mutații ale genelor implicate în trombofilie, dacă sarcina este bine controlată și monitorizată atent de către medicul curant, bebelușul se poate naște sănătos și la termen.

 

Scopul.

 

Diagnosticul trombofiliei ereditare, prin testarea ADN-ului pentru anumite mutații.

 

Indicaţii pentru testare:

Analize de genetică moleculară pentru evaluarea unor mutaţii ce pot cauza:

  • tromboze venoase, paralizie (prin accident vascular cerebral) la vârstă relativ tânără, infarct miocardic;
  • infertilitate, eşec fertilizare in vitro;
  • avorturi spontane;
  • hipotrofie fetală;
  • deces fetal în timpul travaliului;
  • anomalii congenitale multiple la nou-născut;
  • gravide cu preeclampsie severă, abrupţia placentei, retard al creşterii intrauterine, mortinatalitate (raportul dintre numărul copiilor născuți morți și nașterile normale) [Price D.T. et al.,1997].

 

Teste recomandate și semnificaţia clinică:

  • Factorul V (mutaţia Leiden):

Mutaţia – o substituţie mononucleotidică în gena codificatoare a factorului V în poziţia 1691 G>A – are drept consecinţă înlocuirea argininei cu glutamina în poziţia 506 a produsului proteic (R506Q – Leiden). Mutaţia conferă factorului V activat rezistenţă la acţiunea proteolitică a proteinei C (care, împreună cu proteina S şi cu antitrombina III, formează sistemul anticoagulant), creând astfel premisele formării de trombi [Gerhardt A. et al.,2000].

Mutaţia se moştenește autozomal dominant. Mutația FV Leiden sporește riscul trombozelor. Riscul homozigoţilor de a dezvolta tromboembolii este de până la 80 de ori mai mare decât cel al populaţiei generale, în timp ce heterozigoţii au un risc de doar 5-7 ori mai mare [Asselta R.,2006].

  • Protrombina (Factorul II; PTH) G20210A:

Mutaţie moştenită autosomal dominant. Mutaţia duce la acumularea protrombinei de câteva ori mai mult decât în mod normal. Induce o stare de hipercoagulabilitate uşoară. Frecvenţa formei heterozigote a mutaţiei în populaţia europeană este de 2-3%. Forma homozigotă se întâlneşte foarte rar. Riscul de formare a trombilor creşte de 4-8 ori [De Stefano V. et al.,2001].

  • PAI-1 (Inhibitorul Activatorului Plasminogenului tisular tip 1) 4G/5G:

Inhibitorul activatorului plasminogenului (PAI-1) deţine un rol important în procesul fibrinolitic. Acesta inhibă conversia plasminogenului în plasmină, fapt ce reduce fibrinoliza – proces fiziologic de degradare a cheagului sangvin. Genotipul mutant 4G/4G este asociat cu creşterea nivelului plasmatic de PAI-1 şi scăderea activității fibrinolitice cu o predispoziție la tromboze.

 

Materiale şi metode.

Grupul de cercetare l-au constituit pacientele centrului medical cu probleme ale reproducerii, inclusiv avorturi spontane și pierderi de sarcină recurente. ADN-ul genomic a fost extras după kit-uri specializate (GeneJet Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit, Fermentas) din sânge periferic. Probele de sânge au fost colectate în tuburi de unică folosinţă cu EDTA, prin puncţie venoasă.

Pentru testarea genetică a polimorfismelor FV G1691A, FII G20210A, PAI-1 5G/4G s-au realizat reacţiile PCR/RFLP (reacţie de polimerizare în lanţ și polimorfismul lungimii fragmentelor de restricţie) cu primeri specifici preluaţi din articolele din literatura de specialitate [Yingying Tang et al., Abukishe et al., Akar N. et al.]. ADN-ul genomic a fost amplificat utilizând polimeraza Dream Taq („Fermentas”, SUA), la termociclul „TProfessional Basic 96” (Biometra, Germania). Condiţiile reacţiei sunt similare pentru toate polimorfismele cu excepţia temperaturii de aliniere a primerilor: 55°C pentru FV G1691A, 55.6°C pentru FII G20210A, 56.2°C pentru PAI-1 5G/4G, iar condiţiile protocolului standard sunt: denaturare iniţială la 95°C ‒ 3 minute, 33 cicluri: la 94°C ‒ 30 secunde, 55-56.2°C ‒ 30 secunde, 72°C ‒ 30 secunde şi elongaţia finală la 72°C ‒ 5 minute.

Ampliconii pentru fragmentul FV au fost supuși restricţiei timp de 3 ore la 37°C cu enzima specifică Mnl I; ampliconii fragmentului FII ‒ la t° de 65°C timp de 1 oră cu restrictaza TaqI, iar fragmentul PAI-1 a fost restrictat cu enzima BseLI la 55°C timp de 2 ore. Verificarea produşilor de restricţie s-a efectuat prin electroforeză în gel de PAAG (poliacrilamidă) cu concentraţia de 7.5%, în condiţiile: 200 V timp de 3 ore. Gelul a fost colorat cu soluţie de bromură de etidiu. Rezultatele au fost vizualizate la sistemul – UV SOLO (Germania). Mărimile fragmentelor sunt reflectate în figura 1.fig1

http://www.repromed.md/wp-content/uploads/2014/11/fig1.png

Figura 1. Electroforegrama analizei PCR / RFLP a polimorfismelor genelor FV, FII și PAI-1:

  1. A) FV G1691A: M ‒ marker de 50pb; 1 ‒ amplicon (227 pb); 4-8 ‒ homozigot normal (114,75,38 pb); 2 ‒ heterozigot (152,114,75,38pb); 3 ‒ homozigot după mutaţie (152,75 pb);
  2. B) FII G20210A: M ‒ marker de 50 pb; 3,4 ‒ homozigot normal (93,25 pb); 1 ‒ heterozigot (118,93,25 pb); 2 ‒ homozigot după mutaţie (118 pb);
  3. C) PAI-1 5G/4G: M ‒ marker de 50 pb; 2 ‒ homozigot normal (77,22 pb); 3,5 ‒ heterozigot (99,77,22 pb); 4 ‒ homozigot după mutaţie (99 pb).

 

 

Rezultate şi discuţii. Datele au fost obținute în perioada 2012 – 2013, după investigarea unui număr total de pacienți:

  • pentru factorul V (Leiden) – 199 pacienți;
  • pentru factorul II (Protrombina) – 116 pacienți;
  • pentru PAI-1 (4G/5G) – 152 pacienți.

Rezultatele genotipării sunt prezentate în diagramele 1, 2 și 3. Pentru evaluarea veridicităţii rezultatelor obţinute au fost utilizate formulele general acceptate din statistica variaţională, cu ajutorul programului SISA. În acest context, au fost calculate frecvenţele alelelor și claselor genotipice după formula lui Hardy-Weinberg, iar pentru compararea frecvenţelor genotipurilor s-a utilizat criteriul lui Pirson – X2 .

2

 Diagrama 1. Repartiţia frecvenţei claselor genotipice după polimorfismul G1691A al factorului V

 3

Diagrama 2. Repartiţia frecvenţei claselor genotipice după polimorfismul G20210A al factorului II

 4

Diagrama 3. Repartiţia frecvenţei claselor genotipice după polimorfismul 4G/5G al PAI-1

 

 

La compararea repartiţiei frecvenţei genotipurilor observate în raport cu cele teoretic aşteptate prin testul X2 nu a fost elucidată deviaţie statistic semnificativă de la echilibrul Hardy-Weinberg nici pentru un polimorfism studiat: FV G1691A (X2=0.084; p>0.05); FII G20210A (X2=0.036; p>0.05); PAI-1 5G/4G (X2=0.527; p>0.05).

 

 

Riscul de tromboză [University of Illinois, Hematology Resource Page]

Statut trombotic Risc Statut trombotic Risc
Normal 1 Mutația heterozigotă a protrombinei G20210A 3
COC (Contraceptive orale) 3 Mutația heterozigotă a protrombinei G20210A + COC 16
Factor V Leiden heterozigot 5-7 Hiperhomocisteinemie 2-4
Factor V Leiden homozigot 80 Hiperhomocisteinemie +Factor V Leiden heterozigot 20
Factor V Leiden heterozigot + COC 30-35 COC + Factor V Leidenheterozigot + Hiperhomocisteinemie 50-60
Factor V Leiden homozigot + COC >100

 

Femeile gravide au un risc sporit pentru tromboză venoasă, embolismul pulmonar fiind o cauză majoră a mortalității materne.

 

 

 

 

Riscul trombozei venoase

La negravide
Factorul V (mutaţia Leiden) 5-6 ori
Mutația protrombinei G20210A 2-3 ori
Mutația MTHFR 1-2 ori
La gravide
Factorul V (mutaţia Leiden) 9-12 ori
Mutația protrombinei G20210A 8-10 ori
Mutația MTHFR 2-3 ori

 

Complicații obstetricale ale trombofiliei [Moşin Veaceslav,2010] :

  • Dereglări de implantare și eșecuri repetate FIV;
  • Avorturi spontane habituale;
  • Preeclampsia (hipertensiunea arterială indusă de sarcină);
  • Retard în dezvoltarea intrauterină a fătului;
  • Oligohidroamnios;
  • Dezlipirea precoce a placentei;
  • Moarte intrauterină inexplicabilă a fătului;
  • Tromboflebită în timpul sarcinii;
  • Tromboembolism post-partum de 3-8 ori mai frecvent ca antepartum.

 

Trombofilia și patologia sarcinii:

  • Trimestrul I (defecte de implantare):
  • Mutația factorului V Leiden
  • Sindromul antifosfolipidic
  • Hiperhomocisteinemia
  • Trimestrul II (tromboză placentară):
  • Mutația factorului V Leiden
  • Mutația genei protrombinei G20210A
  • Sindromul antifosfolipidic
  • Patologia sarcinii (retard în dezvoltarea fătului, preeclampsie, dezlipirea placentei):
  • Deficiența antitrombinei, proteinei C sau proteinei S
  • Hiperhomocisteinemia
  • Mutația factorului V Leiden
  • Mutația genei protrombinei G20210A
  • Sindromul antifosfolipidic.

 

Tratamentul trombofiliei:

 

Nu toate femeile depistate cu mutații pentru trombofilia ereditară au nevoie de tratament în timpul sarcinii. Gravidele ar trebui să primească o consultație la medicul specialist despre riscurile care pot apărea din cauza cheagurilor și despre complicațiile din timpul sarcinii, dar și despre severitatea trombofiliei, înainte de a decide dacă au nevoie de tratament. Pentru fiecare caz în parte schema tratamentului poate fi absolut diferită.

 

Factori de risc reversibili:

  • Nutriție echilibrată: fructe, legume, pește, carne negrasă;
  • Stoparea fumatului;
  • Evitarea consumului de cafea;
  • Scăderea greutății, exerciții fizice, mișcare;
  • Controlul hipertensiunii;
  • Scăderea colesterolului;
  • Evitarea folosirii estrogenilor;
  • Reducerea stresului.

Terapia se va recomanda preconcepţional, pe parcursul sarcinii și postnatal, cu ajustarea dozelor pentru fiecare perioadă:

  • anticoagulantă (mutaţii prezente în FV, F-II, PAI-1): Heparină, Warfarină;
  • antiagregantă (mutaţii în genele glicoproteinelor receptorilor trombocitari): Aspirină, Dipiridamol, Curantil.
  • Terapie de corecţie a metabolismului homocisteinei (Hcy):
  • Acid folic (1-4 mg/zi);
  • Vitamnia B6;
  • Vitamina B12;
  • Acizi graşi polinesaturați (Omega-3);
  • Limitarea aportului metioninei prin dietă, aport controlat al aminoacizilor prin reducerea ingerării proteinelor.

 

Concluzii.

Testarea ADN-ului în vederea depistării purtătorilor mutaţiilor a genelor care pot cauza trombofilia, reprezintă o condiţie obligatorie în cazul în care istoricul personal sau familial al celor ce urmează să fie expuşi la factori ambientali care cresc coagulabilitatea conţine elemente sugestive pentru existenţa unei trombofilii ereditare sau dobândite.

 

 

Bibliografie.

  1. Abukishe A. et al., Molekulargenetische Diagnostik von Mutationen im Faktor-II und   Faktor-V-Gen, Hämostaseologie 2006; 26: 197–200
  2. Akar N. et al., Effect of Plasminogen Activator Inhibitor-1 4G/5G Polymorphism in Turkish Deep Vein Thrombotic Patients with and without FV1691 G-A, Thrombosis Research 97 (2000) 227–230
  3. Asselta R, Tenchini ML, Duga S. Inherited defects of coagulation factor V: the hemorrhagic side. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2006; 4: 26–34.
  4. Colman R.W., Hemostasis and thrombosis : basic principles and clinical practice. 4th ed. 2001, Philadelphia
  5. De Stefano V. et al., The risk of recurrent venous thromboembolism among heterozygous carriers of the G20210A prothrombin gene mutation. Br J Haematol, 2001. 113(3): p. 630-5
  6. Dilara Fatma Akın, et al., Factor V Leiden and Prothrombin 20210A Mutations among Turkish Pediatric Leukemia Patients. Leukemia Research and Treatment,Volume 2012, Article ID 250432, 4 pag.
  7. Gerhardt A. et al., Prothrombin and factor V mutations in women with a history of thrombosis during pregnancy and the puerperium. N Engl J Med, 2000. 342(6): p. 374-80
  8. Kupferminc M.J. et al., Increased frequency of genetic thrombophilia in women with complications of pregnancy. N Engl J Med, 1999. 340(1): p. 9-13
  9. Moşin Veaceslav, Ginecologie reproductivă, Chişinău, 2010, 856 p.
  10. Price D.T. and P.M. Ridker, Factor V Leiden mutation and the risks for thromboembolic disease: a clinical perspective. Ann Intern Med, 1997. 127(10): p. 895-903
  11. Rees D.C., M. Cox, and J.B. Clegg, World distribution of factor V Leiden. Lancet, 1995. 346(8983): p. 1133-4
  12. University of Illinois – Hematology Resource Page –

      http://www.med.illinois.edu/hematology/Downloads.htm

  1. Yingying Tang et al., Mutation analysis in fatal pulmonary thromboembolism – postmortem validation study and beyond, International Congress Series 1288 (2006) 786‒788